Zawartość witaminy D ufortyfikowanego mleka i formuły dla niemowląt ad

Osad ponownie wyekstrahowano metanolem i ponownie odwirowano. Supernatanty połączono, wysuszono w atmosferze azotu i ponownie rozpuszczono w chlorku metylenu. Dodano pięć mililitrów 0,2 N fosforanu disodu (przy pH 10,5) i mieszaninę odwirowano. Fazę organiczną (niższą) usunięto, a fazę wodną ponownie wyekstrahowano chlorkiem metylenu. Frakcje chlorku metylenu wysuszono i rozpuszczono w 2 ml 50% metanolu w wodzie. Próbkę naniesiono na nabój C-18 (Analytichem International, Harbor City, CA). Kolumnę eluowano wodą destylowaną, 70% metanolu w destylowanej wodzie, a następnie acetonitrylu, po czym witaminę D eluowano metanolem. Frakcję metanolową osuszono w atmosferze azotu i ponownie rozpuszczono w 1% alkoholu izopropylowym w n-heksanie, po czym frakcjonowano przez wysokosprawną chromatografię cieczową w normalnej fazie z użyciem kolumny krzemionki Econosphere (wielkość cząstek 5 .m, 250 przez 4,6 mm, Alltech Associates, Deerfield, IL.) przy 1,1 ml na minutę. Frakcje zawierające witaminę D2 (ergokalcyferol) i witaminę D3 zebrano, wysuszono w atmosferze azotu i rozpuszczono w 25 procentach metanolu w acetonitrylu. Witaminę D2 i witaminę D3 rozdzielono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej na kolumnie Vydac C-18 z odwróconą fazą (250 x 4,6 mm, rozmiar cząstek 5 .m, Rainin Instruments, Woburn, MA).
Rysunek 1. Rysunek 1. Wysokosprawne chromatogramy odwrócone próbek zawierających znane ilości witaminy D2 i witaminy D3 (górny panel) oraz ekstrakt lipidowy mleka zawierającego witaminę D3 (dolny panel). Ekstrakt lipidowy wytworzono z mleka pełnego klasy E, zakupionego 10 lipca 1991 r. Absorbancję zmierzono przy długości fali 254 nm.
Stężenia witaminy D2 i witaminy D3 określono przez porównanie obszarów pod szczytami dla każdej witaminy z obszarami pików otrzymanych przez wysokosprawną chromatografię cieczową próbek zawierających znane ilości witaminy D2 lub witaminy D3 (ryc. 1). Odzyskiwaną radioaktywność określono w celu zmierzenia całkowitego odzysku zarówno witaminy D2, jak i witaminy D3, a wyniki skorygowano dla tego wyzdrowienia. Odzysk witaminy D2 i witaminy D3 z kolumny z odwróconymi fazami był taki sam; typowa odzyskana ilość wynosiła 50 do 70 procent, a współczynniki testu wstępnego i między testami dla testu na obecność witaminy D wynosiły odpowiednio 8 procent i 10 procent.
W celu oznaczenia stężenia witaminy D w preparacie dla niemowląt, 5 ml ciekłej formuły lub 0,5 g sproszkowanej formulacji zmydlono i ekstrahowano jak opisano wcześniej12; następnie wykonaliśmy dwustopniową procedurę chromatograficzną, jak opisano dla próbek mleka.
Wyniki
Figura przedstawia reprezentatywny wysokosprawny ciekły chromatograf odwróconej fazy standardowej witaminy D2 i witaminy D3 oraz ekstraktu lipidowego mleka. Było wyraźne oddzielenie witaminy D2 i witaminy D3 od zanieczyszczeń lipidowych absorbujących promieniowanie ultrafioletowe. Aby mieć pewność, że witamina D3 w mleku była stabilna podczas przechowywania, zmierzyliśmy w trzech powtórzeniach stężenie witaminy D3 w próbkach mleka pełnego i odtłuszczonego w dniu zakupu i po przechowywaniu w lodówce (w temperaturze 4 ° C) przez siedem dni (do daty wygaśnięcia)
[patrz też: kryteria wyrównania cukrzycy, telefon zaufania depresja, badanie hcv cena ]